新聞中心
跨膜蛋白在細胞內外物質交換和信息傳遞中起著關鍵作用，是細胞維持正常生命活動及對環(huán)境信號做出響應所必需的。許多跨膜蛋白的生理功能依賴于與特定配體分子的相互作用。因此，探究跨膜蛋白與配體分子識別和結合的機制一直是生物學研究的重點課題。從頭設計能夠結合特定配體分子的跨膜蛋白，是蛋白質設計領域的重要目標之一。實現這一目標不僅在生物傳感、分子檢測等生物學工具的研發(fā)領域具有巨大應用潛力，還能深化我們對跨膜蛋白與小分子配體相互作用機制的認識，意義重大。
然而，由于膜環(huán)境與膜蛋白本身的復雜性，膜蛋白在表達、純化和表征上面臨諸多挑戰(zhàn)，導致其在蛋白質結構數據庫（PDB）中的結構數量相對較少。人們對膜蛋白折疊、定位和功能機制的理解不如水溶蛋白深入，因此跨膜蛋白的從頭設計難度更大。由于小分子結合蛋白的從頭設計問題尚未完全攻克，再加之跨膜蛋白骨架采樣的局限性以及在疏水性膜環(huán)境中構建空腔和極性相互作用等挑戰(zhàn)，使得精確設計能夠特異性結合指定配體的跨膜蛋白成為一項懸而未決的難題。 北京時間2025年2月20日，西湖大學未來產業(yè)研究中心、生命科學學院、西湖實驗室盧培龍課題組，在Nature雜志在線發(fā)表題為De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins的論文，首次實現了跨膜熒光激活蛋白的從頭設計，這也是第一個通過人工設計得到的能夠非共價結合特定小分子的跨膜蛋白。 在這項最新研究中，研究團隊使用 Rosetta 軟件進行序列設計和優(yōu)化，結合 AlphaFold2 進行結構預測和驗證。首先設計了一個穩(wěn)定的四螺旋束結構的水溶性熒光激活蛋白（wFAP），該蛋白具有一個中央口袋，能夠結合并激活熒光配體（HBC599），其中 wFAP1.1 和 wFAP1.2 變體表現出較高的熒光激活能力和結合親和力，與 HBC599 的親和力達到納摩爾級別，使其熒光亮度激活超過 1600 倍，結合態(tài)的亮度和量子產率均優(yōu)于常用的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）。 在 wFAP 的基礎上，研究團隊通過重新設計表面氨基酸殘基，將其轉化為跨膜蛋白，同時盡量減少對配體結合口袋結構的擾動。使用 ColabDesign 框架進行跨膜序列的生成，結合AlphaFold2 進行結構預測和優(yōu)化，從而設計出了跨膜熒光激活蛋白（tmFAP）。其中，tmFAP1.2 變體表現出最高的結合親和力和量子產率。冷凍電鏡結構驗證顯示，這些蛋白的結構與設計模型高度一致。研究團隊還在活細菌和真核細胞中表達了這些設計的 tmFAP 蛋白，結果顯示，這些蛋白在細胞中表達后會自發(fā)定位到細胞膜組分中，并能夠特異性激活熒光配體（HBC599）的熒光，且在膜環(huán)境中表現出較高的亮度和量子產率。 該研究采用深度學習方法，解決了設計跨膜區(qū)時引起的核心結構及配體結合口袋結構擾動問題，實現了小分子結合跨膜蛋白的精確設計，為跨膜蛋白的從頭設計提供了新范式。該方法使小分子結合跨膜蛋白的設計不再依賴天然蛋白骨架，且可針對任意小分子進行設計，為定制化功能的跨膜蛋白從頭設計奠定了基礎，如轉運體蛋白及配體門控離子通道等。此外，可以沿用設計 tmFAP 的思路，進一步開發(fā)可遺傳編碼的生物探針。在膜蛋白穿膜區(qū)設計熒光化學探針結合位點，使其響應膜兩側的物理或化學信號。這種生物探針不僅具有膜蛋白可控表達的組織和位置特異性優(yōu)勢，還兼具化學探針的高靈敏度和高信噪比特性，在檢測跨膜電壓和 pH 梯度等方面具有廣闊的應用前景。 在本研究中，使用了Implen Nanophotometer? N60用于跨膜熒光激活蛋白tmFAP的濃度測量，以通過公式計算相對熒光單位RFU值，獲得tmFAP的熒光表征。Nanophotometer?采用的樣品壓縮法，無需依賴于樣品的表面張力，在檢測過程中無需形成樣品液柱，特別適合于測量膜蛋白的濃度（含去垢劑樣品），廣泛應用于（膜）蛋白結構生物學研究領域，如納米盤構建及冷凍電鏡樣品濃度定量。新的科研成果，總有Implen的身影，Nanophotometer? - 蛋白質科學研究的好伙伴。
