為何要檢測(cè)內(nèi)毒素 圖片

為內(nèi)毒素?zé)o處不在

內(nèi)毒素又稱(chēng)為脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分子量范圍為3,000至4,000Da，由長(zhǎng)鏈復(fù)合多糖尾部和疏水脂質(zhì)基團(tuán)組成（圖1）），是大多數(shù)格蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成部分，具有較高的熱穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)菌在活躍生長(zhǎng)或在死亡分解時(shí)，細(xì)胞壁中的脂多糖就被釋放到周?chē)h(huán)境中。

圖1.脂多糖結(jié)構(gòu)。內(nèi)毒素為復(fù)合脂多糖，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的活性結(jié)構(gòu)成分。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側(cè)鏈（O-抗原）和脂質(zhì)組分（脂質(zhì)A）組成。

使用如大腸桿菌(E.coli)生產(chǎn)的重組蛋白，或者提取革蘭氏陰性菌內(nèi)的核酸時(shí)經(jīng)常遇到內(nèi)毒素污染問(wèn)題。內(nèi)毒素污染的蛋白質(zhì)/抗體/核酸在轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中或者注入到動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，可引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和/或敗血癥。因此，內(nèi)毒素的去除對(duì)于人類(lèi)疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的，尤其對(duì)于基因藥物、蛋白藥物、抗體藥物、疫苗等生物制品的下游純化處理來(lái)說(shuō)就顯得非常重要。

中國(guó)藥典的規(guī)定

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（通則 1143）包括兩種方法：凝膠法和光度測(cè)定法，后者又包括濁度法和顯色法，可以選用其中任何一種方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。凝膠法和光度法各具優(yōu)點(diǎn)和局限：

凝膠法

凝膠法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法進(jìn)行檢驗(yàn)。

凝膠法的干擾試驗(yàn)是確定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)挑選與鱟試劑反應(yīng)呈陰性的樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。若樣品稀釋到 MVD(有效稀釋倍數(shù)) 仍不能排除干擾作用，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)供試品的前處理進(jìn)行研究，再用干擾試驗(yàn)驗(yàn)證能否使用凝膠法。

光度法

光度法（包括濁度法和顯色法）可定量檢測(cè)內(nèi)毒素的含量，能較為準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，更易達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。

由于光度法的檢測(cè)限范圍比凝膠法寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數(shù)，對(duì)于部分使用凝膠法無(wú)法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。

常用實(shí)驗(yàn)方法和干擾分析

鱟試劑是從海洋動(dòng)物鱟提取的血細(xì)胞溶解物,是檢測(cè)革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的一種敏感試劑。其實(shí)驗(yàn)原理如圖2所示：

圖2.鱟試劑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。LPS（內(nèi)毒素）激活質(zhì)膜結(jié)合因子C。活化的因子C激活因子B，活化的因子B激活凝固酶原，生成凝血酶。加入顯色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA后，活化的蛋白酶-凝血酶催化對(duì)硝基苯胺（pNA）的釋放，產(chǎn)生黃色。通過(guò)測(cè)量405nm處吸光度值進(jìn)行定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可推算得出結(jié)果。紅色表示無(wú)活性酶，綠色表示活性酶。

通常實(shí)驗(yàn)流程：

Thermo提供光度法內(nèi)毒素定量試劑 (A39552）。那么試劑的品質(zhì)如何？我們將從靈敏度、數(shù)據(jù)重復(fù)性、抗干擾性等幾個(gè)角度對(duì)Pierce內(nèi)毒素定量試劑盒的性能進(jìn)行驗(yàn)證：

數(shù)據(jù)靈敏度和重復(fù)性

提供兩個(gè)線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍：0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL（圖3）。使用此試劑盒的實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)和操作者-操作者差異系數(shù)（CV）為3%。靈敏度高可以有效地避免內(nèi)毒素定量中潛在的假陰性或者假陽(yáng)性。

圖3.Pierce內(nèi)毒素定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示出優(yōu)異的線(xiàn)性度，r2= 0.99。Pierce顯色法內(nèi)毒素定量試劑盒的較低標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍為0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)表示使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和阿米巴樣細(xì)胞裂解物培養(yǎng)14分鐘，隨后使用顯色底物培養(yǎng)6分鐘。對(duì)于較低濃度，使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和阿米巴樣細(xì)胞裂解物培養(yǎng)30分鐘，隨后使用顯色底物培養(yǎng)6分鐘。低濃度標(biāo)準(zhǔn)品（0.01-0.1 EU/mL）顯示出了一致性和再現(xiàn)性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鱟試劑可能受許多因素影響，造成假陰性或假陽(yáng)性。包括：

i. 反應(yīng)溫度、樣品酸堿度、離子強(qiáng)度和金屬離子（如鎂和鈣）

ii. 血清蛋白、核酸、脂肪酸、表面活性劑和螯合劑（如EDTA和肝素）可引起內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)的變化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性干擾：鱟試劑會(huì)與其反應(yīng)，造成假陽(yáng)性結(jié)果

表1.使用Pierce顯色法內(nèi)毒素定量試劑盒，獲得有效內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果所兼容的高濃度。所列出的濃度是指樣品中添加0.5 EU內(nèi)毒素時(shí)，未使定量值降低的實(shí)際濃度。以比例的形式表示稀釋濃度，其中1:100表示100倍稀釋

需要指出的是：Pierce顯色法內(nèi)毒素定量試劑盒（貨號(hào)A39552）與β-葡聚糖兼容，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的樣品中，未顯示出增強(qiáng)作用。

內(nèi)毒素去除

超濾、多粘菌素B親和樹(shù)脂以及基于樹(shù)脂或膜的色譜法是內(nèi)毒素去除的傳統(tǒng)方法，這些方法在蛋白回收率、內(nèi)毒素結(jié)合能力等方面具有局限性，有的甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高載量?jī)?nèi)毒素去除樹(shù)脂(88270)，是基于ε-聚賴(lài)氨酸親和樹(shù)脂（天然賴(lài)氨酸的聚合物），顯示出內(nèi)毒素結(jié)合能力和蛋白質(zhì)回收率：

? 結(jié)合力可以達(dá)到2,000,000 EU/mL

? 在處理初始內(nèi)毒素水平為10,000 EU/mL的樣品時(shí)，去除效率可以達(dá)到99%以上

圖4.采用Pierce高通量?jī)?nèi)毒素去除樹(shù)脂去除內(nèi)毒素的效率。（A）內(nèi)毒素去除和定量的工作流程。（B）測(cè)定和去除蛋白質(zhì)樣品中的內(nèi)毒素以備下游應(yīng)用。