在《Biacore檢測(cè)蛋白與小分子相互作用的常見(jiàn)問(wèn)題（上）》中我們著重介紹了在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及樣品準(zhǔn)備方面的問(wèn)題，在本文的下篇中，我們還是從智薈專(zhuān)線收集的客戶(hù)咨詢(xún)出發(fā)，將繼續(xù)討論在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中和最終的數(shù)據(jù)分析階段可能遇到的常見(jiàn)問(wèn)題，并逐一揭開(kāi)上篇中遺留的各個(gè)懸念……

一、 關(guān)于溶劑校正的問(wèn)題

溶劑校正流程貫穿于前期的樣品準(zhǔn)備、之后的樣品檢測(cè)以及最后的數(shù)據(jù)分析，是檢測(cè)蛋白與小分子相互作用實(shí)驗(yàn)中非常關(guān)鍵的一個(gè)步驟，也是Biacore檢測(cè)蛋白與小分子互作的一大優(yōu)勢(shì)。

什么情況下需要進(jìn)行溶劑校正？

當(dāng)運(yùn)行緩沖液中含有高折光率（refractive index）的成分，且此時(shí)在活通道上的配體量較高時(shí)，運(yùn)行緩沖液流經(jīng)活性通道時(shí)會(huì)存在一定的體積排阻效應(yīng)，導(dǎo)致活性通道與參比通道上的信號(hào)存在差異[1]（如下圖1所示）。

1. 運(yùn)行緩沖液的高折光率與高偶聯(lián)造成活性通道與參比通道的信號(hào)差異[1]。

如果運(yùn)行緩沖液以及不同濃度的分析物樣品的折光率能保持嚴(yán)格一致，則上述的通道間差異也是一個(gè)定值了，將不會(huì)對(duì)最終互作結(jié)果產(chǎn)生影響；然而實(shí)際情況下，由于樣品配制誤差等原因，緩沖液與分析物樣品間的折光率誤差往往難以避免。以DMSO為例，1% DMSO的加入會(huì)導(dǎo)致響應(yīng)值信號(hào)上升約1200 RU[1]，而小分子分析物本身與配體結(jié)合產(chǎn)生的響應(yīng)值是較小的，因此DMSO濃度的微小變化也會(huì)引起顯著的影響。此時(shí)就需要進(jìn)行溶劑校正，來(lái)修正這種由于高折光率物質(zhì)（例如DMSO等）濃度的細(xì)微偏差導(dǎo)致的響應(yīng)值信號(hào)顯著變化，得到最準(zhǔn)確的互作數(shù)據(jù)。

2如何進(jìn)行溶劑校正？

以最常見(jiàn)的DMSO為例，溶劑校正的核心思路是設(shè)置一系列含有不同濃度DMSO的校正溶液，濃度范圍覆蓋實(shí)驗(yàn)中所用的DMSO濃度（例如運(yùn)行緩沖液和分析物樣品中均含5% DMSO，則校正溶液中濃度范圍可以是4.5% - 5.8%），以此來(lái)包含樣品與buffer配制過(guò)程中引入的DMSO濃度的誤差。使校正溶液按照濃度順序（從低到高或者從高到低）依次進(jìn)樣，流經(jīng)參比通道與活性通道后，以參比通道的響應(yīng)值為橫坐標(biāo)、活性通道扣減參比通道的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得到溶劑校正曲線（如下圖2所示）。根據(jù)樣品在參比通道的信號(hào)，就可以通過(guò)校正曲線對(duì)應(yīng)得到活性通道扣減參比通道的校正值。而此過(guò)程在Biacore上，都是全自動(dòng)完成的，有專(zhuān)用向?qū)匠绦蛑敢?，無(wú)需手動(dòng)操作。

2. 典型的溶劑校正曲線示意圖[1]。

3

如何判斷溶劑校正的結(jié)果是否正常？

如果按照上述的例子，對(duì)含有5% DMSO的樣品以4.5% - 5.8%的范圍進(jìn)行溶劑校正，最終得到的溶劑校正曲線橫坐標(biāo)范圍一般要落在-500 到 +1000 RU，校正曲線圖譜中的兩條豎線代表的是分析物中DMSO濃度范圍，要求落在校正曲線的范圍內(nèi)，并且擬合的Chi2值小于2[1][2]。

如果溶劑校正的結(jié)果出現(xiàn)異常，可以留意以下幾方面的問(wèn)題：（1）建議使用高品質(zhì)的DMSO試劑，并且使用相同來(lái)源的DMSO溶解小分子和配制所需溶液。（2）注意校正溶液的配制策略，例如只需配制含4.5%和5.8% DMSO的這兩種緩沖液，中間梯度通過(guò)這兩種溶液按照不同比例混合得到，而不需要一個(gè)個(gè)單獨(dú)配制。（3）由于DMSO具有吸潮的性質(zhì)，在配制過(guò)程中應(yīng)及時(shí)封閉，避免長(zhǎng)時(shí)間敞口放置；在上機(jī)檢測(cè)時(shí)，也應(yīng)該對(duì)樣品管進(jìn)行密封。為此，Biacore獨(dú)特的全密閉樣品艙設(shè)計(jì)，及配套專(zhuān)用的孔板封膜及EP管橡膠蓋就派上用場(chǎng)了。

關(guān)于溶劑校正步驟的具體操作方法，可以掃描文末二維碼，查閱《Easy Biacore: T200 檢測(cè)蛋白與小分子結(jié)合》中的相關(guān)內(nèi)容。

二、結(jié)果分析中的相關(guān)問(wèn)題

正確的溶劑校正是后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的前提，得到最終可分析的結(jié)果后，可能還面臨下面這些問(wèn)題。

1

應(yīng)該選擇哪種擬合模式？

關(guān)于擬合模式的選擇，是選擇動(dòng)力學(xué)（Kinetics）分析還是親和力（Affinity）分析，主要是根據(jù)響應(yīng)值圖譜的形狀來(lái)判斷的。對(duì)于動(dòng)力學(xué)分析，要求響應(yīng)值圖譜在結(jié)合和解離階段均展現(xiàn)出足夠的曲率（“慢結(jié)合慢解離”），而親和力分析則要求在每次的分析物進(jìn)樣階段均達(dá)到穩(wěn)態(tài)（steady state）。對(duì)于同時(shí)滿(mǎn)足兩種要求的響應(yīng)值圖譜，理論上兩種分析模式均可以使用。關(guān)于不同響應(yīng)值圖譜形狀以及可選的擬合模式，可參考如下圖3[3]。

3. 不同形狀的響應(yīng)值圖譜與適用的擬合模式的對(duì)應(yīng)關(guān)系示意圖[3]。

如同在上篇所提到的，蛋白與小分子的相互作用在大部分情況下是“快結(jié)合快解離”的，在結(jié)合與解離階段的曲線未能呈現(xiàn)足夠的曲率，而在每次分析物進(jìn)樣后，曲線快速上升并達(dá)到平臺(tái)，因此適用于親和力（Affinity）分析。而在解離階段曲線快速下降至接近基線的特點(diǎn)，也使得蛋白與小分子互作檢測(cè)中一般不需要設(shè)置額外的再生步驟。

2

如何判斷擬合結(jié)果的好壞？

這是很多實(shí)驗(yàn)者在面對(duì)自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)會(huì)發(fā)出的“靈魂拷問(wèn)”，同樣也是Biacore另一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)之處：具有智能數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估系統(tǒng)，能夠以圖形化顯示方式來(lái)評(píng)估檢測(cè)結(jié)果。能夠?qū)z測(cè)結(jié)果自動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并給出相應(yīng)參數(shù)，以此判斷數(shù)據(jù)可信度與準(zhǔn)確度。由于篇幅有限，我們這里主要討論蛋白與小分子互作常用的親和力分析結(jié)果的評(píng)價(jià)。

是使用Biacore結(jié)果分析軟件得到的典型的親和力分析結(jié)果，在Report界面，顯示的參數(shù)有KD（以M為單位）、Rmax、offset以及Chi2，相應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

1

擬合得出的KD值（即擬合曲線中豎線所在的橫坐標(biāo)值）應(yīng)該盡可能落在分析物濃度范圍之內(nèi)，最好在最高濃度的一半以?xún)?nèi)。

2

當(dāng)擬合得到的實(shí)際Rmax值顯著高于理論計(jì)算值時(shí)，說(shuō)明結(jié)合反應(yīng)未按照1：1的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行，有可能出現(xiàn)了非特異性結(jié)合或者分析物分子的聚集。對(duì)于小分子樣品來(lái)說(shuō)，往往由于溶解度等問(wèn)題發(fā)生聚集導(dǎo)致上述現(xiàn)象。而造成擬合得到的實(shí)際Rmax值低于理論計(jì)算值的原因，主要還是偶聯(lián)的配體中有一定比例的分子未充分暴露結(jié)合活性。如果上述兩種情況同時(shí)存在，此時(shí)僅通過(guò)Rmax值難以判斷，需要通過(guò)其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)驗(yàn)證。

3

offset代表的是零濃度時(shí)的響應(yīng)值，這個(gè)值應(yīng)該趨近于0；如果出現(xiàn)了異常高的值或者負(fù)值，需要檢查參比通道和零濃度的響應(yīng)值 [3] 。

4

Chi2值反映了擬合結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的接近程度，這個(gè)值越小，代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果與擬合模型越接近。

4. Biacore分析軟件中典型的親和力擬合結(jié)果界面 [2] 。

3

 關(guān)于非特異性吸附的問(wèn)題

非特異性吸附的來(lái)源是多樣的，最常見(jiàn)的應(yīng)該是分析物分子在參比通道芯片表面的吸附，其次可能還來(lái)源于分析物樣品中其他雜質(zhì)成分在參比通道或者配體上的非特異性結(jié)合，甚至還可能是分析物分子在配體上的吸附（例如小分子在配體蛋白非活性位點(diǎn)的弱結(jié)合等）。要判斷是否存在非特異性吸附，最主要的判斷依據(jù)是看Binding to reference這部分參數(shù)，該參數(shù)反映了每個(gè)循環(huán)的分析物在參比通道上的吸附情況。作為建議，可以按照以下標(biāo)準(zhǔn)判斷：如果Binding to reference的值大于活性通道扣減參比通道（如Fc=2-1）得到信號(hào)值的20%，則可以認(rèn)為存在較顯著的非特異性吸附。

要解決非特異性吸附問(wèn)題，主要可以從以下三方面入手：

1

改變芯片表面或者分析物的性質(zhì)。比較直接的方法是調(diào)換配體與分析物的位置，即固定會(huì)發(fā)生非特異性吸附的原分析物，將原配體作為分析物流經(jīng)芯片表面進(jìn)行分析。然而在蛋白與小分子的互作實(shí)驗(yàn)中，固定小分子會(huì)面臨諸多問(wèn)題（如上篇中所述），因此這個(gè)方案在解決小分子的非特異性吸附中不常用。其次可以考慮改變參比通道的處理方法。在使用CM系列芯片偶聯(lián)配體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，參比通道可以不作任何處理，也可以進(jìn)行活化與封閉。這兩種處理方式下的芯片表面性質(zhì)有所不同，改變處理方式或許可以減弱非特異性吸附。另外，非特異性吸附的來(lái)源還可能是分析物中的雜質(zhì)，那么提高分析物的純度可能也有助于減弱這種吸附。

2

改變緩沖液條件抑制吸附的發(fā)生。非特異性吸附發(fā)生所依賴(lài)的作用力主要就是離子型相互作用或者疏水型相互作用，前者可以通過(guò)提高離子強(qiáng)度來(lái)抑制，而后者可以通過(guò)添加一定濃度的表面活性劑進(jìn)行屏蔽。常規(guī)緩沖液中NaCl濃度在150 mM附近，可以考慮在原運(yùn)行緩沖液中額外添加鹽（至~300 mM甚至500 mM）。Cytiva提供含有表面活性劑P20的運(yùn)行緩沖液，工作濃度一般為0.05%。需要注意的是，在提高鹽濃度或者加入表面活性劑的過(guò)程中，配體與分析物的相互作用可能也會(huì)受到一定程度的影響。

3

調(diào)整分析物的濃度范圍。非特異性吸附往往呈現(xiàn)出非常明顯的濃度相關(guān)性。對(duì)于小分子分析物，有可能發(fā)生的情況是，當(dāng)濃度達(dá)到某個(gè)值以上時(shí)，小分子的溶解情況出現(xiàn)變化，容易發(fā)生聚集沉淀等問(wèn)題，導(dǎo)致非特異性吸附的信號(hào)陡然上升。對(duì)于上述情況，可以考慮調(diào)整分析物的濃度范圍，將非特異性吸附的信號(hào)控制在相對(duì)不顯著的范圍之內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，分析物的濃度范圍的確定還要考慮KD擬合的需要（如上篇中所述），因此這個(gè)方法不一定能找到合適的濃度范圍。

面對(duì)實(shí)際出現(xiàn)的非特異性吸附問(wèn)題時(shí)，往往是以上三方面綜合考慮，進(jìn)而嘗試解決。

至此，關(guān)于Biacore檢測(cè)蛋白與小分子互作的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行步驟和數(shù)據(jù)分析過(guò)程的常見(jiàn)問(wèn)題也已分享完畢。一個(gè)成功的Biacore實(shí)驗(yàn)需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品準(zhǔn)備以及結(jié)果分析等各階段進(jìn)行問(wèn)題的排查與調(diào)整，檢測(cè)蛋白與小分子互作的實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)出現(xiàn)形形色色的問(wèn)題，但是造成這些問(wèn)題的主要原因應(yīng)該都在這兩篇討論的內(nèi)容中了，很多情況下未知的現(xiàn)象往往是已知的原因?qū)е碌?。萬(wàn)變不離其宗，希望這上下兩篇的分享能給大家?guī)?lái)一些提示與啟發(fā)。

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